周昌是沛人，他和堂兄周苛都在秦时担任泗水士卒。刘邦在沛县起兵的时候，打败了泗水郡的郡守、郡监，二兄弟以后就追随刘邦。
公元前203年，楚军在荥阳把刘邦团团围住，情况紧急，刘邦悄悄逃跑出围，命令周苛留守荥阳城。楚军围荥阳，周苛以“反国之臣，难与共守”为由杀了魏豹。楚军攻破荥阳，想任命他为将领，周苛痛斥道：“你们这些人应该赶快投降汉王，不然的话，很快就要做俘虏了！”项羽听罢大怒，立刻就烹杀了周苛。于是，刘邦拜周昌为御史大夫。周昌经常跟随汉王，并且多次击败项羽军。因此，在高祖六年（前201）时，周昌和萧何、曹参一起受封，周昌被封为汾阴侯，周苛的儿子周成因父亲为国捐躯的原因，也被封为高景侯。
周昌为人坚忍刚强，敢于直言不讳，连萧何、曹参等人对他都非常敬畏。周昌有一次在刘邦休息时进宫奏事，刘邦正在和戚夫人拥抱、亲热。周昌见此情景调头便跑。刘邦急忙追上去，骑在周昌的脖子上问道：“汝既来复去，想是不愿与朕讲话，究竟看朕为何等君主呢？”周昌嘴唇乱动片刻，挺直脖子说道：“陛下好似桀纣哩！”刘邦听了虽然大笑，但由此更加敬畏周昌。
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